СВЯЗЬ асимметрии реакции избегания с асимметрией морфологических признаков У плотВЫ RUTILUS RuTILUS (CYPRINIDAE: CYPRINIFORMES)

Е. И. Извеков, Ю. В. Чеботарева, Ю. Г. Изюмов, В. А. Непомнящих, Е. Н. Медянцева

Институт биологии внутренних вод РАН – ИБВВ, Борок Ярославской области

 E-mail: izvekov@ibiw.yaroslavl.ru

АННОТАЦИЯ

У плотвы Rutilus rutilus обнаружена асимметрия начальной стадии реакции избегания – С-образного изгиба тела. Одни особи при действии электрического раздражителя изгибались преимущественно влево, а другие – вправо. Знак и величина асимметрии в целом сохранялись при повторном тестировании особи через 10 дней. Выявлена достоверная корреляция поведенческой асимметрии с билатеральной асимметрией площади парных костей черепа (положительная связь с асимметрией лобных костей и отрицательная – с асимметрией теменных костей). Не обнаружено корреляции между асимметрией поведения и билатеральной асимметрией других морфологических признаков (число отверстий преоперкуло-мандибулярного, надглазничного и надвисочного каналов боковой линии в плоских костях черепа – зубных, предкрышечных, лобных и теменных; число прободенных чешуй боковой линии, а также число лучей в грудных и брюшных плавниках).

ВВЕДЕНИЕ

Поведенческим реакциям рыб свойственна асимметрия, принимающая разнообразные формы. В зависимости от видовой принадлежности, рыбы предпочитают поворачивать вправо или влево при обходе препятствий, двигаться по часовой стрелке или против нее по периметру аквариума, следить за различными объектами правым или левым глазом. Эту асимметрию простых реакций рыб многие исследователи считают эволюционным предшественником асимметрии более сложных когнитивных функций мозга высших позвоночных и человека (см. обзоры: Rogers, 2002; Vallortigara, Bisazza, 2002). Учитывая эволюционную роль поведенческой асимметрии рыб, важно изучить ее происхождение, и в частности, выяснить ее связи с асимметрией различных морфологических признаков. Установление такой связи показало бы, что в основе как поведенческой, так и морфологической асимметрии могут лежать общие причинные факторы. Напротив, отсутствие связи между асимметрией той или иной поведенческой реакции и морфологической асимметрией позволило бы предположить, что эти виды асимметрии формировались в ходе эволюции независимо одна от другой.

Различают групповую и индивидуальную асимметрию поведенческих реакций. Если направление реакции у большинства особей в экспериментальной выборке совпадает, то имеет место групповая асимметрия. Если при многократном повторении реакции одна и та же особь предпочитает определенное направление, независимо от наличия групповой асимметрии, то асимметрию называют индивидуальной (Бианки, 1985; Nepomnyashchikh, Izvekov, 2006). Пока имеются лишь разрозненные сведения о связи между морфологической асимметрией рыб и проявлениями их поведенческой асимметрии на индивидуальном или групповом уровне. Так, Perissodus microlepis (Cichlidae) нападают на других рыб и поедают их чешую. У них обнаружена асимметрия рта, который у одних особей смещен влево, а у других – вправо по отношению к продольной оси тела. Этой морфологической асимметрии соответствует асимметрия поведения: особи с левосторонним положением рта поедают чешую на правом боку жертвы, а с правосторонним положением – на левом боку (Hori, 1993). У данио‑рерио Brachydanio rerio (Cyprinidae) обнаружена корреляция асимметрии ряда поведенческих реакций с билатеральной асимметрией расположения структур эпиталамуса (поводка и парапинеального ганглия), а также сердца, кишечника и поджелудочной железы. В то же время, для асимметрии реакции избегания, вызванной резким изменением освещенности, такой корреляции обнаружено не было (Barth et al., 2005).

Эти сведения противоречивы и недостаточны для понимания взаимоотношений между асимметрией поведенческих и морфологических признаков. Противоречивость данных частично объясняется и тем, что асимметрия многих поведенческих реакций изменчива и зависит от текущего состояния рыб, например от уровня мотивации, привыкания к обстановке эксперимента, возраста и других факторов (Nepomnyashchikh, Izvekov, 2006). Так, у мозамбикской тиляпии Oreochromis mossambicus (Cichlidae) асимметрия движения по периметру круглого аквариума может быть замаскирована реакциями на зрительные раздражители (Непомнящих, Гремячих, 1993), а у золотой рыбки Carassius auratus (Cyprinidae) направление этой асимметрии изменяется в ходе эксперимента (Непомнящих, 2005).

Указанная изменчивость заставляет искать поведенческие реакции с асимметрией, достаточно устойчивой для того, чтобы можно было определить ее морфологические корреляты. С этой целью мы исследовали асимметрию реакции избегания у плотвы Rutilus rutilus (Cyprinidae) и ее связь с асимметрией ряда морфологических признаков. Данная реакция известна у рыб многих видов и наблюдается при неожиданном действии самых разных раздражителей, в том числе вибрационных (Heuts, 1999), звуковых (Bisazza et al., 2005) и зрительных (Bisazza et al., 1997, 2005). Реакция заключается в том, что тело рыбы изгибается в горизонтальной плоскости в виде буквы «С», обращенной вправо или влево. Как правило, латентный период С-старта не превышает 40–70 мс от момента стимуляции (Domenici, Blake, 1997; Karlsen et al., 2004). Принято считать реакцию асимметричной, если при повторении реакции направление С‑образного изгиба в большинстве случаев оказывается одним и тем же (Heuts, 1999; Bisazza et al., 2005). За изгибом следует быстрый бросок в сторону, позволяющий рыбе уйти от потенциальной опасности.

Проведенные нами предварительные наблюдения показали, что у плотвы асимметрия этой реакции, вызванной звуковым стимулом, проявляется сильнее и более устойчива, чем асимметрия другой реакции – движения по периметру аквариума. Еще более устойчивой асимметрия реакции избегания плотвы оказалась в том случае, когда ее вызывали электрическим током. Воспроизводимые показатели асимметрии в повторных опытах наблюдались также у дженинсии Jenynsia lineata (Anablepidae) при использовании зрительного раздражителя (Bisazza et al., 1997). Эта устойчивость, а также простота регистрации реакции избегания делают ее удобной экспериментальной моделью для решения поставленной нами задачи.

Изучение связи реакции избегания рыб с асимметрией различных морфологических признаков только начинается. Возможность существования подобной связи была показана при изучении таких признаков, как степень развития мышц (Heuts, 1999) и размер маутнеровских нейронов (Михайлова и др., 2005а,б,в). В то же время не было обнаружено связи реакции избегания с асимметрией эпиталамуса и ряда висцеральных органов (Barth et al., 2005). И наконец, предпринята всего одна попытка установить степень корреляции между предпочитаемым направлением реакции избегания у рыб и уровнем флуктуирующей асимметрии, причем ни один из 4 исследованных морфологических признаков не был связан с асимметрией реакции избегания (Bisazza et al., 1997).

Однако отсутствие корреляции может объясняться тем, что для анализа были выбрана лишь небольшая часть парных морфологических признаков. Поэтому мы исследовали более широкий набор из 10 признаков:

- площади парных костей черепа: лобных (frontale) и теменных (parietale);

- число отверстий надглазничного канала боковой линии (ll) в лобных и теменных костях;

- число отверстий надвисочного канала ll в теменных костях;

- число отверстий преоперкуло-мандибулярного канала ll в парных костях черепа: зубных (dentale) и предкрышечных (praeoperculum);

- число прободенных чешуй боковой линии;

- число лучей в грудных и брюшных плавниках.

Ранее было показано, что перечисленные признаки существенны для характеристики фенетической изменчивости карповых рыб, в том числе плотвы (Яковлев и др., 1981). Мы сравнили асимметрию этих признаков с асимметрией начальной стадии реакции избегания – С-образного изгиба тела – при действии электрического тока.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Объект исследования и условия эксперимента. Икра плотвы была получена путем искусственного оплодотворения в мае 2005 г. от производителей, пойманных в р. Сутка (приток Рыбинского водохранилища). После рассасывания желточного мешка личинок высадили в пруд, где они росли до середины сентября. Затем рыб перенесли в лабораторию и до начала опытов на протяжении 6 мес содержали при естественной продолжительности светового дня в том же помещении, где проводились эксперименты.

В течение первых 3 мес сеголетки находились в общем аквариуме объемом 300 л с проточной водой. За 3 мес до начала эксперимента 11 особей, отобранных для опытов случайным образом, были отсажены в индивидуальные аквариумы объемом 50 л с постоянной аэрацией воды и в дальнейшем содержались поодиночке. Как при совместном, так и при раздельном содержании сеголетков их ежесуточно кормили рыбным фаршем, грунт и водные растения в аквариумах отсутствовали. Температура воды во всех аквариумах приблизительно соответствовала сезонному ходу температуры воды в р. Сутка (15–17°С в сентябре–октябре и 4–6°С в декабре–январе).

Эксперименты проводились в феврале–марте 2006 г. К началу опытов рыбы достигли возраста 8–9 мес (длина от конца рыла до конца чешуйного покрова – 59–65 мм, масса – 2.8–3.6 г). С каждой особью проведено два эксперимента с интервалом в 10 сут. Между опытами рыб содержали в их индивидуальных аквариумах объемом 50 л, при естественной продолжительности светового дня, прежнем режиме кормления и температуре 9.5 ± 2°С. Эксперименты проводили при такой же температуре, с каждой особью отдельно, в аквариуме из серого непрозрачного пластика (30 ´ 30 ´ 30 см). Уровень воды составлял 12 см, электропроводность – 33–38 мСм/м. Установка равномерно освещалась сверху люминесцентными лампами. Во время опыта рыб не кормили. После эксперимента с каждой особью воду в аквариуме меняли, чтобы избежать накопления сигнальных метаболитов.

Две противоположные стенки аквариума были закрыты электродами – пластинами из нержавеющей стали. Напряжение на электродах создавали с помощью генератора ГЗ‑56/1. Раздражителем служил синусоидальный электрический сигнал частотой 50 Гц и продолжительностью 0.5 c. Напряженность однородного электрического поля составляла 50 мВ/см. Эти параметры раздражения, вызывавшие у всех особей четкую реакцию избегания при каждом включении тока, были подобраны в ходе предварительного тестирования рыб, не участвовавших в дальнейших экспериментах. На дне аквариума, перпендикулярно электродам, были нанесены три черные параллельные линии. Одна из них соответствовала оси симметрии аквариума, две других отстояли от нее на 7 см вправо и влево.

Электростимуляция. Поместив рыбу в аквариум, ждали, когда она начнет активно перемещаться (26 ± 5 мин), а затем предоставляли ей еще 10 минут для ознакомления с обстановкой. Раздражитель предъявляли каждый раз, когда рыба оказывалась в центральной части аквариума, ограниченной крайними разметочными линиями, а продольная ось ее тела была ориентирована параллельно этим линиям и, соответственно, параллельно силовым линиям электрического поля. При стимуляции расстояние между головой рыбы и ближайшим электродом было равно 10–20 см. После 16-го предъявления раздражителя эксперимент прекращали. Промежутки времени между последовательными предъявлениями составляли от 1 до 50 мин (в среднем 4.30 ± 0.32 мин).

Регистрация и анализ реакций рыб. Над аквариумом была установлена цифровая видеокамера Panasonic NV-GS 400 GC, регистрировавшая движения рыб с частотой 25 кадров в секунду, т.е. через каждые 40 мс. В момент подачи раздражителя автоматически включался светодиод (невидимый рыбе), что служило меткой начала стимуляции для последующей обработки данных. Как известно, каждый кадр видеозаписи состоит из двух последовательных «полукадров» продолжительностью по 20 мс. Первый из этих полукадров содержит четные строки кадра, а второй – нечетные. Поскольку среди ответов плотвы на электрический раздражитель имелись реакции с латентным периодом порядка 20 мс, при компьютерной обработке таких записей полукадры разделяли с помощью программы Adobe Photoshop 7.0. Устранение чересстрочной развертки позволило фиксировать движения рыб с необходимой частотой (50 полукадров в секунду, т.е. каждые 20 мс). Аналогичная методика анализа видеозаписей уже использовалась ранее (Bisazza et al., 2005).

Для оценки различий в частоте С-изгибов вправо и влево у каждой особи применяли двухсторонний биномиальный критерий (Рунион, 1982). Кроме того, для каждой рыбы вычисляли показатель асимметрии, равный 100*(R – L) / (R +L), где R – число изгибов вправо, а L – влево. Вычисляли также среднюю величину этого показателя для всех 11 особей. Для оценки связи между показателями асимметрии особей, полученными в первом и втором экспериментах, использовали непараметрический коэффициент корреляции Спирмена (r_s).

Морфометрический анализ. После второго эксперимента рыб замораживали, взвешивали, измеряли длину и подсчитывали число прободенных чешуй в боковой линии с левой и правой стороны тела, а также число лучей в отпрепарированных грудных и брюшных плавниках. Затем рыб вываривали для того, чтобы извлечь осевой скелет и парные кости: лобные, теменные, предкрышечные и зубные. В этих костях подсчитывали число отверстий каналов боковой линии, отдельно для левой и правой костей. Кроме того, лобные и теменные кости фотографировали цифровой фотокамерой Olympus C5060 в режиме макросъемки с расстояния 7 см от объектива до объекта. Для лучшей контрастности кости подкрашивали азур-эозином. Площадь костей на фотографиях определяли с помощью программы Image-Pro Plus 3.00 и выражали в квадратных миллиметрах.

При анализе морфологических признаков использовали тот же показатель асимметрии, что и для реакции избегания: 100*(R – L) / (R + L), где R – величина признака на правой стороне тела, а L – на левой стороне. При оценке связи между этими показателями для разных морфологических признаков, а также их связи с показателями асимметрии реакции избегания использовали коэффициент корреляции Спирмена. Лобная кость одной из рыб была повреждена при обработке, поэтому корреляцию между асимметрией площади лобных костей и асимметрией реакции избегания вычисляли только для 10 особей.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Реакция избегания Реакция избегания у плотвы при воздействии электрического раздражителя начиналась с ярко выраженного С‑образного изгиба тела. В момент изгиба угол разворота передней части корпуса относительно исходной ориентации оси тела составлял 30–60°. В большинстве случаев (56%) изгиб прослеживался в третьем полукадре после начала электростимуляции и значительно реже – во втором (15%) или четвертом (18%) полукадрах. Учитывая, что длительность полукадра равна 20 мс, можно сделать вывод, что латентный период C‑старта плотвы, как правило, варьировал в пределах от 20 до 60 мс и чаще всего составлял около 40 мс.

Показатели асимметрии особей в первом и втором экспериментах связаны между собой тесной положительной корреляцией (коэффициент корреляции r_s = 0.93, p = 0.000037). У большинства особей (9 из 11) знак асимметрии совпадал в обоих экспериментах (рис. 1). Это означает, что асимметрия С-изгиба плотвы представляет собой устойчивую индивидуальную характеристику.

Рис. 1. Связь между показателями асимметрии реакции избегания у плотвы в первом и во втором экспериментах. Каждая точка обозначает отдельную особь (порядковые номера рыб соответствуют нумерации в табл. 1).

Показатели асимметрии каждой особи приведены в таблице 1, из которой видно, что некоторые рыбы статистически значимо чаще изгибаются влево, а другие – вправо. Ввиду очевидной устойчивости реакции показатель асимметрии для каждой особи допустимо рассчитывать по сумме всех 32 ее реакций в обоих экспериментах. При таком способе вычисления статистически значимая асимметрия обнаруживается у 8 особей из 11, причем у 6 рыб С-изгиб направлен преимущественно влево, а у 2 – вправо. У оставшихся 3 особей имела место лишь слабая тенденция изгибаться влево или вправо (табл. 1).

Таблица 1. Показатели асимметрии (%) С-образного изгиба при реакции избегания у плотвы

Примечание. Отрицательные значения соответствуют С-изгибу, направленному влево.

N – число регистраций реакции избегания у каждой особи. Звездочками обозначены показатели рыб, у которых доля изгибов влево или вправо статистически значимо отличалась от 50% (биномиальный критерий, * – p < 0.05; ** – p < 0.01; *** – p < 0.001).

M ± tm – среднее значение показателя и доверительный интервал для p = 0.05.

Как в каждом из экспериментов по отдельности, так и при объединении их результатов средний показатель асимметрии для всей выборки был отрицательным (табл. 1), но эта общая тенденция изгибаться влево оказалась недостоверной (p > 0.05).

Поскольку эксперименты проводились на свободно плавающих рыбах, временной интервал между последовательными предъявлениями раздражителя заметно варьировал (коэффициент вариации C_v = 135%), что могло повлиять на направление изгиба тела. Чтобы проверить данное предположение, мы определили среднюю продолжительность указанного интервала в двух различных ситуациях. В первом случае анализировали промежутки между теми реакциями, которые следовали друг за другом в одном и том же направлении (n = 216). Во втором случае оценивали интервалы, разделявшие те реакции, которые сопровождались изменением направления изгибов (n = 109). Достоверных различий между средними значениями (соответственно 4.7 ± 0.5 мин и 3.5 ± 0.3 мин) не наблюдалось (p > 0.05). Это означает, что промежуток времени между последовательными реакциями при электрической стимуляции плотвы в условиях эксперимента не оказывал существенного влияния на направление изгиба плотвы, которое в первую очередь определялось индивидуальной асимметрией ответа.

Морфологические признаки. Показатели асимметрии большинства исследованных морфологических признаков (табл. 2) были невелики и варьировали у разных особей в пределах от –4.5 до +3.6%. По четырем признакам у некоторых особей отмечались значения асимметрии, превышающие ± 10%. Асимметрия двух признаков, числа отверстий надвисочного канала ll в теменных костях и числа лучей в брюшных плавниках, у всех особей была равна нулю. Средние показатели асимметрии всей выборки не были статистически значимыми ни для одного из исследованных морфологических признаков (во всех случаях p > 0.10). Доли особей с противоположным знаком асимметрии в выборке также не различались статистически значимо (биномиальный критерий, p > 0.05).

Несмотря на малую величину, показатели асимметрии площадей лобных и теменных костей были связаны сильной отрицательной корреляцией (r_s = –0.88, р = 0.001). Кроме того, обнаружена положительная корреляция асимметрии числа отверстий преоперкуло-мандибулярного канала ll в зубных костях с асимметрией числа отверстий в предкрышечных костях (r_s = 0.84, p = 0.001), а также с асимметрией числа лучей в грудных плавниках (r_s = 0.66, p = 0.02). В свою очередь, две последние асимметрии также были связаны положительной корреляцией (r_s = 0.56, p = 0.08). Наличие сильной корреляции между асимметрией перечисленных признаков показывает, что эта асимметрия статистически значима, несмотря на ее небольшую величину.

С другой стороны, не обнаружено корреляции между асимметрией всех остальных морфологических признаков (во всех случаях p > 0.10). Другими словами, асимметрия этих признаков не может считаться статистически доказанной.

Связь асимметрии реакции избегания и морфологических признаков. Для оценки связи между поведенческой и морфологической асимметрией использовали показатели асимметрии реакции избегания, вычисленные по объединенным данным обоих экспериментов (табл. 1, колонка 4). Связь показателя асимметрии С-изгиба с длиной рыб (r_s = 0.13) и их массой (r_s = 0.22) оказалась незначительной (p > 0.05). Корреляция поведенческой асимметрии с асимметрией морфологических признаков показана в таблице 2. Обнаружена статистически значимая положительная связь с асимметрией площади лобных костей и столь же сильная отрицательная связь – с асимметрией площади теменных костей (табл. 2, рис. 2).

Следует отметить, что наличие значимых корреляционных связей между асимметрией площадей лобных и теменных костей и асимметрией реакции избегания еще раз показывает, что асимметрия этих двух морфологических признаков действительно существует, несмотря на ее небольшую величину.

Рис. 2. Связь между показателями асимметрии реакции избегания и площадей костей черепа у плотвы.

Таблица 2. Значения морфологически признаков плотвы, степень их билатеральной асимметрии и корреляция с асимметрией С-изгиба

Примечание. Для признаков, по которым коэффициент асимметрии был равен нулю, коэффициенты корреляции не указаны.

M ± tm – среднее значение показателя и доверительный интервал для p = 0.05.